Optimering av praktiska PCR-maskiner i realtid

Om det är realtidsfluorescenskvantitativ PCR för viruskvantifiering och SNP-genotypning, behöver vi en PCR-maskin med högsta möjliga specificitet; Om det är patogen- och mRNA -detektion behöver vi PCR -maskin med hög känslighet , så hur ska vi optimera denna PCR -maskin?

Här är innehållslistan:

l Förbättra PCR -maskinförstärkningseffektivitet

l Använda PCR-primrar i realtid för allmän PCR

Förbättra PCR -maskinförstärkningseffektivitet

För att förbättra PCR- maskinamplifieringseffektiviteten, specificiteten och känsligheten kan vi optimera den realtidsfluorescens kvantitativa PCR-maskinen för experimentet genom en serie mått. Den första är valet av målsekvensen.

1, Valet av bekväm PCR-målsekvens i realtid lämplig längd mellan 50 och 150 bp. Kortare sekvenser tar mindre tid att syntetisera och ha kortare amplifieringstider, så möjligheten att förorena DNA förstärks minskas.

2 När du väljer målsekvensen använder du BLAST -sökning för att analysera målsekvensen för polymorfismer och sekvenseringsfel och undvika dem. Om det finns duplicerade sekvenser i målsekvensen kommer det att minska detekteringskänsligheten för denna PCR -maskin och bör också undvikas.

3, Kontrollera GC -innehållet ≤ 60% i målsekvensen. Hög GC-innehåll kommer att påverka denaturering av målsekvensen i den termiska cykeln, men också lätt att producera denna PCR-maskin ospecifik amplifiering.

4, undvik att generera sekundär struktur. Målsekvenser med omvända repetitiva sekvenser är enkla att producera sekundär struktur, vilket påverkar hybridiseringen av praktiska PCR-primrar i realtid och sonder.

Utöver detta måste vi också se till att mallens kvalitet inte kommer att påverka förstärkningen, resultaten från den praktiska PCR-maskinen i realtid har tillförlitlighet. Till exempel kan skadat DNA inte förstärkas tillräckligt i PCR -maskinen eller inte förstärks alls. Närvaron av DNA -polymerasinhibering av reagens (DMSO, etc.) och föroreningar (SDS, etc.) i mallen kan också påverka tillförlitligheten för PCR -maskinförstärkningsresultaten.

Använda PCR-primrar i realtid för allmän PCR

Få bekväma i realtid PCR -primrar , denna metod kan också användas för vanlig PCR.

1 bör längden vara 18-30 bp för att säkerställa specificiteten för bindning.

2, smälttemperaturen (TM-värdet) bör vara 55-60 ° C, och TM-värdena för de två primrarna bör skilja sig åt med 2-3 ° C.

3, varje primer bör ha 1 till 3 guaniner eller cytosiner i 3'-änden, vilket bekvämt kan minska den icke-specifika amplifieringen under PCR-maskinen i realtid. Mer än 3 kommer att slå tillbaka och orsaka en 'glideffekt ' som leder till fel förlängning.

4. GC -innehållet i primrarna bör vara cirka 50%, för högt GC -innehåll kommer att öka TM -värdet.

5, PCR -maskinprimrarna bör undvika omvända repetitiva sekvenser, eftersom den kommer att bilda en sekundär struktur, vilket påverkar primerbindningen på mallen.

6, om det är RT-PCR, måste du också undvika att utforma primrar för att binda på exon-sekvenser, vilket kommer att leda till falska-positiva PCR-maskiners experimentella resultat. Rätt tillvägagångssätt bör utformas på den långa intronflanken, eller korta introner, eller över regionen Exon-exon.

7. Desaltning och rening av primrarna.

Observera att ibland, när du har gjort alla punkter, kanske primrarna inte förstärker, så du bör utforma primrarna.

Med fokus på snabb nukleinsyradetektering och POCT snabb detektion erbjuder Bioteke slags labbinstrument som: virusprovtagning, automatisk nukleinsyratextraktor, PCR -maskin och desinficeringsapparater. Och det ger också många typer av reagens och satser.